Beckman Coulter MicroScan Manuel D'utilisation page 64

3. Plokštelę inokuliavę 50 µl inokulianto, švelniai patapšnokite kiekvieną plokštelės kraštą, kad inokuliantas lengviau
susimaišytų su substratu.
PASTABA: jei plokštelė bus nuskaitoma prietaisu „WalkAway" ar „autoSCAN-4", taip pat reikia inokuliuoti LOC šulinėlį.
Inkubavimas
1. Sudėkite plokšteles grupėmis po 3–5 plokšteles su dengiamuoju dėklu ant viršutinės plokštelės, kad apsaugotumėte nuo
garavimo.
2. Inokuliuotas plokšteles 4 valandas inkubuokite ne CO
Plokštelių nuskaitymas
1. Išimkite peptidazės reagentą iš šaldytuvo bent 30 minučių prieš nuskaitydami plokšteles. Peptidazės reagente 4 °C
temperatūroje gali susidaryti nuosėdos, tačiau jos vėl ištirps kambario temperatūroje. Nelaikykite peptidazės reagento
aukštesnėje temperatūroje mėgindami pagreitinti pakartotinį kristalinių nuosėdų ištirpimą, nes aukštoje temperatūroje
reagentas skyla.
2. Plokšteles nuskaitykite naudodami nuo balto fono atspindėtą šviesą.
3. Inkubavę 4 valandas, į atitinkamus šulinėlius įlašinkite peptidazės ir natrio hidroksido (NaOH) reagentų.
A. Į BNAC, HPR, ILE, PRO, TYR, GLY, GGLY, GLAR, GLPR, AARG, LYAL, ALA, STY ir HIS šulinėlius įlašinkite po
1 lašą peptidazės reagento. Prieš užrašydami rezultatus palaukite 30 sekundžių, kol atsiras spalva. Pridėjus
reagento rezultatus reikia užrašyti ne vėliau kaip po 3 minučių. BET KOKIO rožinės ar raudonos spalvos atspalvio
atsiradimas tirpale visame šulinėlyje ar bet kurioje šulinėlio dalyje laikomas teigiama reakcija. Spalvas reikia
palyginti su BNAC šulinėliu. Kai kurie šulinėliai gali būti tamsesnės oranžinės spalvos nei BNAC šulinėlis. Juos
reikia užrašyti kaip neigiamas reakcijas. Reakcijos teigiamos tik tada, jei tirpale yra rožinė ar raudona spalva.
Laikui bėgant spalva šiuose šulinėliuose tamsėja. Neigiamos reakcijos geltona spalva gali pasikeisti į tamsesnę
oranžinę spalvą. Tai reikia interpretuoti kaip neigiamą reakciją.
PASTABA: įlašinus peptidazės į BNAC šulinėlį, jis turi būti geltonas. Jei yra bet kokia rožinė ar raudona spalva,
peptidazės reagento naudoti negalima.
B. Į AGL2, BDF, AGAL, NPC, NAG, CELL ir NGAL šulinėlius įlašinkite po 1 lašą 0,05 N NaOH. Prieš užrašydami
rezultatus palaukite bent 5 sekundes, tačiau ne ilgiau nei 5 minutes. Bet kokį geltonos spalvos atspalvį reikia
užrašyti kaip teigiamą reakciją. Šulinėlius su substratu palyginkite su NPC šulinėliu.
PASTABA: šie šulinėliai gali būti tamsesni nei NPC šulinėlis. Tai reikia interpretuoti kaip neigiamą reakciją. Kad
reakciją būtų galima laikyti teigiama, turi būti geltonos spalvos.
4. Kad būtų lengviau interpretuoti reakcijas, pateikti du kontroliniai šulinėliai.
A. BNAC = β-naftilamido kontrolinė medžiaga. Įlašinus peptidazės reagento šis šulinėlis bus geltonos spalvos.
B. NPC = nitrofenilo kontrolinė medžiaga. Šis šulinėlis turi būti bespalvis.
5. Jei reikia pagalbos atliekant biocheminį interpretavimą, žr. skyrių REZULTATAI.
PASTABA: „WalkAway" pirmiausiai nuskaito tuos šulinėlius, kuriems nereikia reagentų, kad rezultatai nepakistų dėl
reagentų garų, galinčių likti po dėklo dangteliu. Dėl šios priežasties, biocheminių reakcijų negalima patikrinti rankiniu
būdu.
REZULTATAI
Substrato interpretavimas
Well Reagentas
HPR Įlašinkite 1 lašą peptidazės reagento. Palaukite bent
30 sekundžių, bet ne ilgiau nei 3 minutes, kol įvyks
ILE
spalvinė reakcija.
PRO
TYR
GLY
GGLY
GLAR
GLPR
AARG
LYAL
ALA
STY
HIS
SUC1
SUC2
TRE
C29879–AB
inkubatoriuje, 35–37 °C temperatūroje.
2
Teigiamas
Bet koks rožinės,
nuo raudonos iki
rausvos spalvos
1
atspalvis tirpale
Bet koks rudos
spalvos atspalvis
arba geltona
64 of 141
Neigiamas
Nuo geltonos iki
oranžinės
Purpurinė