Beckman Coulter MicroScan Manuel D'utilisation page 24

3. Dopo aver inoculato il pannello con l'inoculo di 50 μL, picchiettare lievemente tutti i lati del pannello per favorire la
miscelazione con il substrato.
NOTA: se la lettura del pannello verrà eseguita sul sistema WalkAway o autoSCAN-4, anche il pozzetto LOC deve essere
inoculato.
Incubazione
1. Impilare i pannelli in gruppi di 3–5 e collocare un coperchio sul pannello superiore per evitare l'evaporazione.
2. Incubare i pannelli inoculati per 4 ore a 35–37 °C in un incubatore non a CO
Lettura dei pannelli
1. Estrarre il reagente peptidasi dal frigorifero almeno 30 minuti prima della lettura dei pannelli. Il reagente peptidasi può
precipitare a 4 °C ma si dissolve nuovamente a temperatura ambiente. Non esporre il reagente peptidasi a temperature
elevate per accelerare la ridissoluzione del precipitato cristallino in quanto le alte temperature causano la degradazione
del reagente.
2. Leggere i pannelli utilizzando luce riflessa da uno sfondo bianco.
3. Dopo 4 ore di incubazione, aggiungere i reagenti peptidasi e idrossido di sodio (NaOH) nei pozzetti appropriati.
A. Aggiungere 1 goccia di reagente peptidasi ai pozzetti BNAC, HPR, ILE, PRO, TYR, GLY, GGLY, GLAR, GLPR,
AARG, LYAL, ALA, STY e HIS. Attendere per 30 secondi lo sviluppo del colore prima di registrare i risultati. I
risultati devono essere registrati entro 3 minuti dall'aggiunta del reagente. La presenza di QUALSIASI sfumatura
di rosa o rosso nella soluzione, nell'intero pozzetto o in una sua parte, va interpretata come un risultato positivo. I
colori devono essere confrontati con il pozzetto BNAC. Alcuni pozzetti possono avere una colorazione arancione
più scura rispetto al pozzetto BNAC. In questo caso, il risultato deve essere registrato come negativo. Le reazioni
sono positive solo in presenza di colore rosa o rosso nella soluzione. Il colore di questi pozzetti si scurisce nel
tempo. Un colore giallo negativo può diventare arancione scuro. Questa reazione deve essere interpretata come
negativa.
NOTA: dopo l'aggiunta della peptidasi al pozzetto BNAC, dovrebbe apparire una colorazione gialla. In presenza
di colorazione rosa o rossa, non usare il reagente peptidasi.
B. Aggiungere 1 goccia di NaOH 0,05 N nei pozzetti AGL2, BDF, AGAL, NPC, NAG, CELL ed NGAL. Attendere
almeno 5 secondi e non più di 5 minuti prima di registrare i risultati. Tutte le sfumature di giallo devono essere
registrate come positive. Confrontare i pozzetti contenenti il substrato con il pozzetto NPC.
NOTA: questi pozzetti possono essere più scuri del pozzetto NPC. Questo risultato deve essere interpretato come
negativo; per essere considerato positivo, deve presentare una colorazione gialla.
4. Sono forniti due pozzetti di controllo per agevolare l'interpretazione delle reazioni.
A. BNAC = controllo β-naftilamide. Dopo l'aggiunta del reagente peptidasi, questo pozzetto diventa giallo.
B. NPC = controllo nitrofenil. Questo pozzetto dovrebbe essere incolore.
5. Per ulteriori informazioni sull'interpretazione biochimica, consultare la sezione Risultati.
NOTA: il sistema WalkAway legge pozzetti che non richiedono di aggiungere prima i reagenti per evitare risultati alterati
causati da eventuali fumi dei reagenti intrappolati sotto il coperchio, pertanto le reazioni biochimiche non possono essere
verificate manualmente.
RISULTATI
Interpretazioni dei substrati
Well Reagente
HPR Aggiungere 1 goccia di reagente peptidasi. Attendere
lo sviluppo della reazione cromatica per almeno 30
ILE
secondi e non più di 3 minuti.
PRO
TYR
GLY
GGLY
GLAR
GLPR
AARG
LYAL
ALA
STY
HIS
SUC1
SUC2
TRE
C29879–AB
Positivo
Tutte le
sfumature di rosa
e da rosso a
magenta nella
1
soluzione
Tutte le
sfumature di
marrone o giallo
24 of 141
.
2
Negativo
Da giallo ad
arancione
Porpora