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Real-time PCR
L'utilisation de la real-time PCR permet la détection des produits de réaction pendant la
phase exponentielle du processus d'amplification par PCR et non à la fin, contrairement à la
PCR en point final. Cela augmente la spécificité du test et réduit le temps nécessaire à la
réalisation du test.
Le principe du dosage repose sur la réaction d'hydrolyse des oligonucléotides pendant la
real-time PCR avec des sondes TaqMan
(4). Trois types d'oligonucléotides sont utilisés pour
®
détecter chaque séquence de bases cible : une paire d'amorces de PCR conventionnelles,
qui sont complémentaires de séquences en amont- et en aval de la séquence cible et forment
un amplicon, ainsi qu'une sonde moléculaire qui est complémentaire de la séquence cible et
comprend un marqueur fluorescent et un quencher de fluorescence à proximité immédiate
l'un de l'autre. L'extrémité 3' de la sonde est un di-désoxyribonucléotide, ce qui permet de
prévenir l'extension de la sonde et l'empêche d'agir comme une autre amorce de la PCR
dans la réaction.
Pendant la PCR, si la séquence cible d'intérêt est présente, elle s'hybride avec la sonde
oligonucléotidique, tandis que les amorces de la PCR s'hybrident avec leur séquence
complémentaire en amont et en aval du site de fixation de la sonde. Dans la phase
d'élongation de l'amorce, l'activité exonucléase 5'–3' de l'ADN polymérase de Thermus
aquaticus (Taq) dégrade la sonde oligonucléotidique, libérant les molécules du marqueur
fluorescent et du quencher de fluorescence. À mesure qu'ils s'éloignent l'un de l'autre par
diffusion dans la solution, l'effet du quencher sur le marqueur diminue, entraînant une
augmentation de la fluorescence détectable. Ce processus intervient à chaque cycle de PCR
et n'interfère pas avec l'accumulation exponentielle du produit (Figure 2).
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Mode d'emploi (manuel) du therascreen FGFR RGQ RT-PCR Kit 08/2019
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