Qiagen therascreen FGFR RGQ RT-PCR Kit Mode D'emploi page 8

La transcription inverse (Reverse Transcription, RT) est effectuée à l'aide du mélange
principal préparé avec l'enzyme transcriptase inverse, les tampons pour RT et le mélange
d'amorces de RT, qui sont tous fournis dans le therascreen FGFR RGQ RT-PCR Kit. La
réaction de RT a lieu à 42 °C et est stoppée par incubation à 95 °C.
La transcriptase inverse est une enzyme multifonctionnelle avec trois activités enzymatiques
distinctes : une activité ADN polymérase ARN-dépendante, une activité exoribonucléase
hybride-dépendante (RNase H) et une activité ADN polymérase ADN-dépendante. Dans la
transcription inverse in vitro, les deux premières activités sont utilisées pour produire des
ADNc simple brin. Tout d'abord, l'activité ADN polymérase ARN-dépendante (transcription
inverse) transcrit l'ADNc à partir d'une matrice d'ARN en formant un hybride ADN:ARN.
Ensuite, l'activité exoribonucléase RNase H dégrade spécifiquement le brin ARN de ces
hybrides (Figure 1). Cette activité affecte donc l'ARN hybridé avec l'ADNc, mais elle est
sans effet sur l'ARN pur. Il n'est pas nécessaire d'avoir recours à une étape distincte de
dégradation de l'ARN avec une enzyme RNase H avant la real-time PCR.
Figure 1. Synthèse de l'ADNc. Transcription inverse et synthèse du premier brin d'ADNc.
Mode d'emploi (manuel) du therascreen FGFR RGQ RT-PCR Kit 08/2019
ARNm
ARNm
ARNm
ADNc
ADNc
Real-time PCR qualitative
AAAAAA
Hybridation de l'amorce
AAAAAA
Transcription inverse
(ADN polymérase
ARN-dépendante)
AAAAAA
Dégradation de
l'ARN (RNase H)
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