Transcription Inverse - Qiagen therascreen FGFR RGQ RT-PCR Kit Mode D'emploi

Si la concentration en ARN est inférieure à 16,67 ng/µl, arrêter le traitement de cet
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échantillon. Une nouvelle extraction d'ARN à partir d'un nouveau prélèvement FFPE doit
être utilisée pour l'analyse.
L'ARN doit être dilué à 16,67 ng/µl à l'aide de l'eau réservée à la dilution des
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échantillons fournie dans le therascreen FGFR RGQ RT-PCR Kit.
La réaction de transcription inverse est optimisée pour 250 ng d'ARN purifié dilué dans
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un volume final de 15 µl (15 µl x 16,67 ng/µl = 250 ng d'ARN).

Transcription inverse

Le therascreen FGFR RGQ RT-PCR Kit fournit des quantités élevées d'ADNc pour assurer la
sensibilité de la détection de tous les transcrits cibles, même lorsqu'ils sont présents en faible
abondance. La transcription inverse utilise une matrice d'ARN et un mélange d'amorces
complémentaires aux extrémités 3' et 5' de l'ARN pour produire de l'ADNc. L'enzyme
transcriptase inverse (Reverse Transcription, RT) synthétise le premier brin d'ADNc, qui sert
ensuite de matrice lors de la PCR effectuée avec le therascreen FGFR RGQ RT-PCR Kit.
Remarques importantes avant de commencer
Préparer toutes les réactions entre 0 et 8 °C afin de réduire le risque de dégradation de
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l'ARN.
L'inhibiteur de la RNase et les dNTP sont déjà inclus dans les composants du kit. Ne pas
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ajouter d'inhibiteur de la RNase ni de dNTP supplémentaires.
Le mélange d'amorces RT fourni doit être utilisé. Ce mélange d'amorces RT est optimisé
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pour fournir des quantités élevées d'ADNc pour toutes les régions des transcrits d'ARN.
Il n'est pas nécessaire d'effectuer d'étapes distinctes de séparation et d'hybridation avant
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de lancer la réaction de transcription inverse.
Après la transcription inverse, la réaction doit être arrêtée par incubation à 95 °C
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pendant 3 minutes pour désactiver la transcriptase inverse.
25 Mode d'emploi (manuel) du therascreen FGFR RGQ RT-PCR Kit 08/2019