Qiagen Rotor-Gene Q MDx CE Manuel D'utilisation page 177

Vérifier les tracés d'amplification aberrants
Avant d'effectuer une HRM, examinez attentivement les données des tracés d'amplification pour
détecter une éventuelle forme anormale. Les tracés qui présentent une phase log-linéaire non
abrupte, qui sont irréguliers ou qui atteignent un plateau de signal faible par rapport à d'autres
réactions peuvent indiquer une amplification médiocre ou un signal de fluorescence trop faible
(cela peut se produire si la concentration de l'amorce était trop faible). Les réactions médiocres
peuvent être dues à des inhibiteurs de réaction ou à une préparation incorrecte de la réaction. Les
données de HRM issues de tels échantillons peuvent être non concluantes ou de faible résolution.
Pour éviter des résultats non fiables, nous recommandons les kits QIAGEN pour la préparation des
échantillons et l'analyse de HRM.
Conserver des concentrations d'échantillons post-amplification similaires
La concentration d'un fragment d'ADN a une incidence sur sa température de fusion (T ). C'est
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pourquoi les concentrations d'ADN de l'échantillon doivent rester similaires autant que possible.
Lorsque vous analysez des produits de PCR, assurez-vous que chaque réaction a amplifié jusqu'à
la phase de plateau. Au niveau du plateau, toutes les réactions doivent avoir amplifié de façon
similaire, quelle que soit la quantité de départ. Notez toutefois que les réactions médiocres peuvent
ne pas atteindre le plateau avec la même quantité amplifiée en raison, par exemple, d'une
configuration de dosage incorrecte (p. ex. la concentration d'amorce était trop faible).
Veiller à l'uniformité d'un échantillon à l'autre
Tous les échantillons doivent être de volume égal et contenir la même concentration de colorant.
Le comportement de fusion de l'ADN est perturbé par les sels dans le mélange réactionnel, il est
donc important que la concentration de tampon, Mg et autres sels soit aussi uniforme que possible
dans tous les échantillons. De même, utilisez uniquement des tubes de réaction identiques d'un
même fabricant pour éviter les variations dues à l'épaisseur du plastique et aux propriétés
d'autofluorescence.
Permettre une collecte de données suffisante pour les phases de préfusion et post-fusion
Capturez les points de données de HRM sur une plage d'environ 10 ºC, centrée autour de la T
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observée (voir la figure page 10). Cela vous donnera une base de points de données suffisante
pour une normalisation de courbe efficace, cela permettra aussi des réplicats plus reproductibles et
facilitera l'interprétation des données.
Manuel d'utilisation du Rotor Gene Q MDx CE 02/2022 177