Analyse Par Pyroséquençage - Qiagen PyroMark Q24 MDx Manuel D'utilisation

Afin de garantir une amplification égale lors d'une analyse
CpG, l'ADN non méthylé peut être mélangé à des quantités
croissantes d'ADN totalement méthylé. Il est recommandé
d'utiliser les kits d'ADN témoins EpiTect qui fournissent des
ADN entièrement méthylés et non méthylés traités par le
bisulfite sous forme de solutions prêtes à l'emploi. L'analyse de
régression de la fréquence d'un allèle mesurée par le
séquenceur PyroMark Q24 MDx en fonction de l'allèle entré
(attendu) doit donner une valeur de R
Dans le cas d'une analyse AQ, les variantes alléliques, y
compris la position variable, peuvent être mélangées dans
différentes proportions comme pour l'analyse CpG. Si la
position variable pour une analyse AQ est un SNP, la façon
la plus simple de mesurer l'égalité de l'amplification est de
comparer la hauteur des pics d'un hétérozygote. Si le SNP
est représenté par l'incorporation d'une seule base, par
exemple AAC/TTG, les deux allèles (pics de C et T) doivent
donner des pics de même hauteur. Une InDel chez un
hétérozygote doit fournir une délétion de 50 %.
Préparation des échantillons
Utiliser 5 à 20 µl d'une solution de PCR de 25 µl pour
l'immobilisation sur des billes Streptavidin Sepharose High
Performance (GE Healthcare) selon les instructions de la
Section 5.3.3. Cela correspond à environ 0,5 à 4 picomoles
de produit de PCR, selon l'efficacité de la réaction.
Remarque : Lors de l'utilisation d'un kit de PCR PyroMark,
5 à 10 µl de produit de PCR donne des résultats de
pyroséquençage satisfaisants dans la plupart des cas. Il
convient d'ajuster le volume pour obtenir une hauteur de pic
mononucléotidique d'au moins 40 RLU sur le pyrogramme.
Analyse par pyroséquençage
Sauf indication contraire, utiliser les paramètres par défaut
du logiciel pour la configuration de toutes les analyses.
Manuel d'utilisation du PyroMark Q24 MDx 01/2016
Glossaire
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