Table des Matières
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Annexe B
Conception et validation de l'analyse
Conception de l'analyse
Les analyses par pyroséquençage peuvent être mises au
point avec la dernière version du logiciel PyroMark Assay
Design Software (ADSW). Le programme génère
automatiquement des jeux d'amorces contenant à la fois des
amorces de PCR et des amorces de séquençage. Chaque jeu
d'amorces est associé à un indice de qualité qui repose sur
plusieurs paramètres spécifiques à l'analyse par
pyroséquençage. Veiller à utiliser le type d'analyse adapté
dans ADSW. Il est recommandé d'utiliser les tests QIAGEN
de diagnostic in vitro pour pyroséquençage qui contiennent
toutes les amorces optimisées nécessaires.
PCR
Pour l'amplification par PCR, il est recommandé d'utiliser le
kit PyroMark PCR (QIAGEN) qui est spécifiquement optimisé
pour l'analyse par pyroséquençage et permet une
amplification hautement spécifique et non biaisée de
matrices d'ADN destinées à différentes applications de
pyroséquençage telles que la détection des mutations,
l'analyse des SNP, l'analyse de la méthylation et la
détermination de la séquence par appel de bases. La forme
pratique sous laquelle se présente le Master Mix permet une
amplification spécifique de différents matériaux de départ
tels que l'ADN génomique d'une grande variété d'espèces
ainsi que l'ADN traité par le bisulfite en un seul protocole.
Amorces de PCR
L'une des amorces doit être marquée par la biotine afin de
permettre l'immobilisation des billes recouvertes de
streptavidine (Streptavidin Sepharose High Performance, GE
Healthcare) pendant la préparation d'une matrice d'ADN
monobrin. L'analyse peut se faire dans le sens de
l'élongation ou dans le sens inverse. Si les amorces sont
Manuel d'utilisation du PyroMark Q24 MDx 01/2016
Glossaire
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