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3. F ür das Ansetzen der Gellösung dürfen nur geeignete Agarosen und entsprechende Elektrophoresepuffer eingesetzt wer-
den. Für die Herstellung der Agarosegellösung wird eine entsprechende Menge Agarose in einem kleinen Erlenmeyerkolben
abgewogen, eine geeignete Menge Elektrophoresepuffer dazugegossen und ein Rührfisch (Erhitzen mit Heizrührer) hin-
zugegeben. Das Gewicht des befüllten Erlenmeyerkolbens wird festgehalten, so dass auftretende Kochverluste durch
Verdampfen durch Zugabe von destilliertem H2O ausgeglichen werden können. So hat die Gellösung tatsächlich die vor-
gesehene Agarosekonzentration. Zum Lösen der Agarose wird der Erlenmeyerkolben entweder in die Mikrowelle gestellt
oder der Erlenmeyerkolben auf einer Heizplatte unter Rühren und bei mittlerer Heizleistung erhitzt. Die Erhitzung in der
Mikrowelle sollte kurz bei mittlerer Hitze erfolgen und mehrfach wiederholt werden. Zwischendurch nimmt man den
Erlenmeyerkolben heraus (Achtung: Handschuhe, Schutzbrille tragen und ggf. auf Siedeverzug achten!) und schwenkt vor-
sichtig die Gellösung kreisförmig. Dann erneut in die Mikrowelle geben und den gesamten Vorgang 3-4 Mal wiederholen
bis die Agarose vollständig gelöst ist.
4. V or dem Gießen des Gels die Gellösung auf 60°C abkühlen. Die Gellösung wird dann luftblasenfrei in die Aussparung zwi-
schen die beiden weißen Kunststoffstreifen des Kammerbodens gegossen (Fassungsvermögen beträgt ca. 40 ml). Dann
den Kamm (oder 2 Kämme) einsetzen. Darauf achten, dass sich keine Luftblasen an den Taschenrändern bilden. Gele aus
Standardagarose sind bei Raumtemperatur in ca. 20 Minuten verfestigt.
5. N ach Verfestigung des Agarosegels mit Elektrophoresepuffer ca. 3 mm überschichten, damit das Gel nicht austrocknet. Das
Gel kann nun nach vorsichtigem Entfernen des Kamms sofort beladen werden. Das überschichtete Gel kann auch für ein
paar Tage aufbewahrt werden, am günstigsten sogar mit eingesetztem Kamm. Das Gel muss lediglich vor Austrocknung
geschützt werden (Abdecken mit Haushaltsfolie).
Beladung von Agarosegelen und Elektrophorese
1. S obald das Agarosegel vollständigt verfestigt ist, wird das Gel mit Elektrophoresepuffer überschichtet bis die max. Füllhöhe
des Puffer („Fill Line") erreicht ist.
2. E ntfernen Sie den Kamm (Kämme) vorsichtig aus dem Agarosegel, indem Sie diese vorsichtig wippend hin- und herbewe-
gen und dann gerade nach oben herausziehen.
3. N un können die Taschen des Gels mit den vorbereiteten Proben beladen werden. Die Proben müssen vorab mit einem
entsprechenden Gelladepuffer versetzt werden, der das spezifische Gewicht der Proben erhöht und somit die Proben beim
Auftragen mit der Mikropipette in die Taschen absinken lässt (vgl. Abschnitt Gelladepuffer).
4. B eim Beladen der Geltaschen die Spitze der Mikropipette vorsichtig leicht in die Tasche tauchen und die Probe langsam
herausdrücken. Dabei bitte nicht den Taschenboden beschädigen.
Dieser Vorgang sollte von Anfängern mit „Übungsproben", die nur aus H2O und Gelladepuffer bestehen, eingeübt werden.
5. A uf jedem Gel sollte mindestens ein Längenstandard mit aufgetragen werden, damit eine Größenbestimmung der aufge-
trennten DNA-Fragmente erfolgen kann.
6. S etzen Sie nun den Sicherheitsdeckel auf die Elektrophoresekammer und schließen Sie die Kammer an ein geeignetes
Netzgerät an.
B itte beachten Sie die richtige Polung. Nukleinsäuren sind im alkalischen bis neutralen Milieu negativ geladen und wan-
dern zur Anode (rote Pol).
7. S chalten Sie die Spannungsquelle ein und führen Sie die Elektrophorese bei einer angemessenen Spannung durch (80 - 120
V). Der Verlauf der Elektrophorese kann anhand der Wanderung des Farbstoffs, der sich im Gelladepuffer befindet, verfolgt
werden.
H äufig werden Bromphenolblau bzw. Xylencyanol als Farbstoffe im Gelladepuffer eingesetzt. Das Laufverhalten
bzw. die sog. Comigration zu doppelsträngigen DNA-Fragmenten ist vom Agarosetyp, von der Gelstärke und vom
Elektrophoresepuffer abhängig.
Z ur Groborientierung: Bromphenolblau läuft in 1xTAE-Elektrophoresepuffer und Standardagarosegel von 1% in etwa
wie ein DNA-Fragment mit 650 Basenpaaren. Unter gleichen Bedingungen läuft Xylencyanol wie ein Fragment mit 5000
Basenpaaren.
Anfärbung von Nukleinsäuren
Da es verschiedene Möglichkeiten der Anfärbung von Nukleinsäuren gibt, wird an dieser Stelle auf die einschlägige
Fachliteratur verwiesen (Sambrock et. al., 1989).
Auswertung / Dokumentation
Größenbestimmungen von Nukleinsäure-Fragmenten können durch Vergleich mit den Fragmenten eines Längenstandards
durchgeführt werden. Eine genaue Beschreibung des Verfahrens findet man z.B. im Fachbuch „Molekulare Genetik" von R.
Knippers (2006).
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