3B 1012852 Mode D'emploi page 12

2. Enlever avec précaution le bouchon de sécurité de la cuve d'électrophorèse.
3. P our la préparation de la dissolution de gel, seule l'utilisation d'agaroses appropriés et de tampons d'électrophorèse con-
formes est recommandée. Pour la production de la dissolution de gel d'agarose, peser la quantité d'agarose correspondante
dans une petite fiole Erlenmeyer, ajouter suffisamment du tampon d'électrophorèse et un agitateur chauffant. Noter le poids
de la fiole Erlenmeyer remplie, pour que des pertes, dues à l'ébullition, puissent être compensées par l'ajout de H2O (distillé).
De cette façon, la dissolution du gel comporte la concentration d'agarose prévue. Pour dissoudre complètement l'agarose,
placer l'Erlenmeyer au four à micro-ondes ou alternativement faire chauffer l'Erlenmeyer sur une plaque chauffante à chaleur
moyenne, en agitant de temps en temps. L'échauffement dans le four à micro-ondes devrait être d'une courte durée, mais
doit être refait plusieurs fois. Entre temps, puiser l'Erlenmeyer (Attention: porter des gants de sécurité, des lunettes protec-
trices et faire attention au retard à l'ébullition éventuelle) et agiter circulairement la dissolution de gel. Puis remettre dans le
four à micro-ondes et refaire tout le processus 3-4 fois jusqu'à que l'agarose soit totalement dissout.
4. A vant de couler le gel, laisser refroidir la dissolution de gel en dessous de 60°C. Puis couler la dissolution de gel dans la
niche se trouvant entre les deux bâtons plastifiés blancs sur le fond de la cuve, sans produire de bulles (capacité: environ
40 ml). Puis, utiliser le peigne (ou les deux peignes). Faire attention qu'il n'y ait pas de bulles aux marges de la niche. Les
gels d'agarose standard figent à température ambiante dans un temps de 20 minutes environ.
5. R ecouvrir le gel d'agarose figé de 3mm du tampon d'électrophorèse, pour qu'il ne s'assèche pas. Retirer soigneusement le
peigne, puis charger le gel. Le gel emballé dans du tampon peut être conservé pendant plusieurs jours, au mieux avec le
peigne placé, avant qu'il ne perde trop d'eau par évaporation (couvrir de film alimentaire).
Chargement des gels d'agarose et de l'électrophorèse
1. L e gel d'agarose complètement figé est à recouvrir avec du tampon d'électrophorèse jusqu''à ce que la hauteur de remplis-
sage maximale du tampon („Fill Line") soit atteinte.
2. Retirer soigneusement le peigne en l'agitant avec précaution puis le dégager en le tenant droit vers le haut.
3. M aintenant, les poches de gel peuvent être chargées des échantillons préparés. Ces échantillons sont à additionner au tam-
pon de charge du gel, qui fait augmenter le poids spécifique des échantillons et fait alors baisser les échantillons, étalés
par une pipette micro, dans les poches. (partie tampon de charge du gel / tampon d'échantillon).
4. A u chargement des poches de gel, immerger avec précaution le bec de la pipette micro dans la poche et faire sortir douce-
ment l'échantillon. Ne pas endommager le fond de la poche.
5. I l est raisonnable que des débutants étudient cette étape en utilisant des „échantillons d'entraînement" qui se composent
uniquement d'H2O et du tampon de charge de gel.
6. P our la détermination de taille des fragments d'ADN séparés, il faut appliquer sur chaque gel au moins un standard de tail-
le.
7. P oser maintenant le bouchon de sécurité sur la cuve d'électrophorèse et brancher la cuve sur une unité de courant appro-
priée. Prendre en considération la polarisation correcte. Dans un milieu basique jusqu'à neutre, les acides nucléiques sont
chargés négativement et vont se déplacer à l'anode (pôle rouge).
8. A llumer la source de tension et procéder à l'électrophorèse sur un voltage approprié (80 – 120 V). Il est maintenant pos-
sible d'observer le déroulement de l'électrophorèse à l'aide du colorant se trouvant dans le tampon de charge du gel.
Il est récurrent de faire intervenir dans ce tampon les colorants bleu de bromophénol ou de xylène cyanole. Le com-
portement lors de la course, aussi appelée comigration par rapport aux fragments d'ADN dépend du type d'agarose et
du tampon d'électrophorèse. Pour une première orientation: le bleu de bromophénol se comporte dans 1x de tampon
d'électrophorèse TAE et un gel d'agarose standard de 1% comme un fragment d'ADN d'une taille de 650 paires de bases.
Dans des conditions égales, le xylène cyanole se comporte comme un fragment d'une taille de 5000 paires de bases.
Coloration des acides nucléiques
Comme il existe plusieurs possibilités pour colorer des acides nucléiques, nous attirons votre attention sur la littérature spécia-
lisée correspondante (Sambrook et. al., 1989).
Evaluation / Documentation
Des déterminations de taille des fragments d'acides nucléiques peuvent être effectuées par la comparaison avec des fragments
du marqueur de taille. Une description détaillée de cette procédure se trouve par exemple dans le livre spécialisé „Molekulare
Genetik" R. Knippers (2008).
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