Préparation De La Pcr - Greiner Bio-One PelvoCheck CT/NG Mode D'emploi

8.2.3 Préparation de la PCR
À l'exception de la HotStarTaq
MasterMix contient déjà tous les composants nécessaires à la PCR (tampon de PCR, MgCl
amorces et modèle de contrôle de PCR).
La HotStarTaq polymérase ne fait pas partie du kit PelvoCheck
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séparément auprès de Qiagen (voir les informations utiles pour la commande au chapitre 2).
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Le kit de test PelvoCheck
chapitre 2). Il est impératif d'utiliser cette polymérase pour atteindre les performances établies.
De manière optimale, la préparation du mélange réactionnel est réalisé dans un environnement
protégé, par exemple sous une hotte à PCR, pour éviter toute contamination de la réaction.
Préparer le mélange réactionnel (composé de PelvoCheck
¯
polymérase et uracil-N-glycosylase) pour la quantité requise de PCR, comme indiqué dans le
Tableau 2 (voir en page 27).
Pour analyser plusieurs échantillons, le mélange réactionnel doit être préparé en lot (dans la quantité
requise pour toutes les analyses). Pour s'adapter aux variations de volume qui surviennent au cours
du pipetage, il est recommandé d'augmenter le nombre de réactions (n) de 1 pour chaque puce (= n
+ 1). Par exemple, préparer un volume de mélange réactionnel pour 13 amplifications si 12 échantillons
doivent être testés (voir le Tableau 2, page 27).
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Il est recommandé d'inclure un contrôle négatif pour chaque lot de PelvoCheck
préparé. Le tampon d'élution d'ADN provenant du kit d'extraction d'ADN approprié ou de l'eau de qualité
PCR peut servir de contrôle négatif.
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Toujours utiliser un flacon de PelvoCheck
Mélanger soigneusement le mélange réactionnel en le passant au vortex pendant 2 secondes
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puis en le centrifugeant, ou en le pipetant plusieurs fois.
Aliquoter le mélange réactionnel en pipetant 21 µL pour chaque PCR, dans un microtube pour
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PCR de 0,2 mL à paroi fine.
Ajouter de l'ADN dans un espace de travail séparé de celui de la préparation du mélange réactionnel
(voir le chapitre 7.2).
Ajouter 5 µl d'extrait d'ADN pour chaque PCR et mélanger en passant au vortex pendant
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2 secondes puis en centrifugeant, ou en pipetant plusieurs fois. Le volume total d'une PCR est
de 26 µL.
Placer les microtubes dans un thermocycleur et lancer la PCR à l'aide du programme du
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thermocycleur indiqué dans le chapitre 8.2.1 (voir le tableau 1, page 24).
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Une fois la PCR terminée, les produits d'amplification doivent être utilisés immédiatement à des fins
d'hybridation ou conservés à l'abri de la lumière, à ≤ -20 °C, pendant trois mois maximum, vu que l'activité
de l'uracil-N-glycosylase peut-être en partie rétablie à des températures inférieures à 55 °C.
PelvoCheck CT/NG - Mode d'emploi
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Révision : BQ-029-03 / Décembre 2014
polymérase et de l'uracil-N-glycosylase, le PelvoCheck
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CT/NG a été validé avec la HotStarTaq® polymérase de Qiagen (voir le
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CT/NG PCR MasterMix pour les réactions d'une puce.
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CT/NG et doit être achetée
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CT/NG PCR MasterMix, HotStarTaq
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CT/NG PCR MasterMix
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CT/NG PCR
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, dNTP,
2
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