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Modes nucléiques (3)
Les acides nucléiques peuvent être quantifiés à 260 nm étant donné qu'il est bien
établi qu'une solution d'ADN ou d'ARN d'une densité optique de 1,0 possède une
concentration de 50 ou 40 µg/l, respectivement, dans une cuve de d'un trajet optique
de 10 mm. Les oligonucléotides, selon la méthode empirique, possèdent un facteur
correspondant de 33 µg/l, bien que cette valeur varie selon la composition de base.
L'extraction des acides nucléiques des cuves est accompagnée par celle des protéines
et la purification extensive est nécessaire pour séparer les impuretés protéiques. Le
rapport 260/280 donne une indication de la pureté ; il ne s'agit cependant que d'une
indication et non pas d'une évaluation définitive. Pour les préparations d'ADN et
d'ARN pures, on escompte des rapports
partir de ces valeurs indique la présence d'impuretés dans l'échantillon, mais il faut
faire preuve de prudence quant à l'interprétation des résultats. Une absorbance élevée
à 230 nm peut également indiquer la présence d'impuretés ; 230 nm est proche du
maximum d'absorbance des liaisons peptidiques et indique également la
contamination du tampon étant donné que Tris, EDTA et d'autres sels tampons
absorbent à cette longueur d'onde. Lors de la mesure des échantillons d'ARN, le
rapport 260/230 doit être > 2,0 ; un rapport inférieur à ce dernier indique généralement
une contamination avec du thicyanate de guanidinium, un réactif couramment utilisé
dans la purification de l'ARN et qui absorbe sur une plage de 230 – 260 nm.
La correction du bruit de fond à une longueur d'onde totalement séparée des pics des
acides nucléiques et des protéines à 260 et 280 nm, respectivement, est quelques fois
utilisée pour compenser les effets de l'absorbance de fond. La longueur d'onde
utilisée est 320 nm et elle peut compenser les effets de turbidité, de la solution tampon
d'absorbance élevée et de l'utilisation de cuves à ouverture réduite.
L'instrument calcule la concentration, affiche les rapports de 260/280 et 260/230 et
compense la dilution et l'utilisation de cuves ne possédant pas un trajet optique de
10mm. Un balayage de longueur d'onde d'un échantillon peut également être obtenu
pour l'inspection visuelle de l'intégrité.
La procédure est la suivante pour ADN (3.1), ARN (3.2) et oligo (3.3):
•
Entrez le trajet optique de la cuve; 10mm (1), 5mm (2), 2mm (3), 1mm (4) ou 0,5mm
(5)
•
Sélectionnez les unités; µg/ml (1), ng/µl (2) ou µg/µl (3)
•
Sélectionnez si la correction de bruit de fond à 320 nm est exigée
•
Sélectionnez si le balayage d'échantillon est exigé (balayage de 220 à 330 nm,
avec mise à l'échelle automatique)
•
Entrez le facteur de dilution
•
[Oligo (3.3) uniquement; entrez le facteur de conversion. S'il n'est pas connu,
utilisez 33]
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___
14
1.8 et
2.0, respectivement; tout écart à
≥
≥
Français
Edition 05 - 09/2002
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