Table des Matières
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Si vous désirez rappeler l'analyse en tant que méthode, réglez la référence avant de
mesurer les échantillons.
Quantification des acides nucléiques (Ultrospec 1100 pro)
Les acides nucléiques peuvent être quantifiés à 260 nm car il est bien établi qu'une
solution d'ADN ou d'ARN d'une densité optique de 1,0 possède une concentration
de respectivement 50 ou 40 µg/ml, dans une cellule à trajet optique de 10mm. Les
oligonucléotides, en règle générale, possèdent un facteur correspondant de 33 µg/ml,
bien que ceci varie en fonction de la composition en base.
L'extraction des acides nucléiques des cellules est accompagnée de celle de
protéines, et une purification extensive est nécessaire pour séparer l'impureté
représentée par ces protéines. Le rapport 260/280 donne une indication de la pureté ;
toutefois, il ne s'agit que d'une identification et en aucun cas une évaluation
définitive. Les préparations d'ADN et d'ARN pures ont des rapports escomptés de
respectivement ≥ 1,8 et ≤ 2,0 ; les écarts à partir de ces valeurs indiquent la présence
d'une impureté causée par les protéines dans l'échantillon, mais il faut rester prudent
en matière d'interprétation des résultats. Une absorbance élevée à 230 nm peut
également indiquer la présence d'impuretés ; 230 nm est proche de l'absorbance
maximum des liaisons peptidiques et indique également une contamination par le
tampon étant donné que le Tris, l'EDTA et d'autres sels tampons absorbent à cette
longueur d'onde. Lors de la mesure des échantillons d'ARN, le rapport 260/230
devrait être > 2,0 ; un rapport inférieur indique généralement la contamination par du
thiocyanate de guanidinium, un réactif couramment utilisé dans la purification d'ARN
et qui absorbe au-delà de la plage 230-260 nm.
La correction du bruit de fond à une longueur d'onde totalement séparée des pics
d'acides nucléiques et de protéines à respectivement 260 et 280 nm, est quelques fois
utilisée pour compenser les effets de l'absorbance de fond. La longueur d'onde
utilisée est 320 nm et elle peut tenir compte des effets de turbidité, de solution
tampon à absorbance élevée et de l'utilisation de cellules à ouverture réduite.
L'instrument calcule la concentration, affiche les rapports 260/280 et 260/230, et
compense la dilution et l'utilisation de cellules qui n'ont pas de trajet optique de
10mm (2mm). Nous déconseillons l'utilisation de cellules contenant moins de 70µl de
solution dans cet instrument (la cellule à microvolume , 80-2103-69, est idéale pour la
quantification d'acide nucléique). La procédure est la suivante :
Entrez le type d'acide nucléique (ADN, ARN, oligo)
[Pour oligo, entrez le facteur de conversion approprié s'il est connu (la valeur par
défaut est 33)]
Stipulez si la correction du bruit de fond à 320nm est exigée
Entrez les unités (µg/ml, ng/µl ou µg/µl)
Entrez le facteur de dilution (plage de 1,0-99999)
Entrez le trajet optique de la cellule utilisée (10, 5 ou 2mm)
Insérez la référence, appuyez sur la touche
. Une référence définie à chacune des
longueurs d'onde désirées est relevée.
Si vous désirez sauvegarder cette analyse en tant que méthode, passez à mise au
point (F3)
Insérez l'échantillon, appuyez sur la touche
.
Les résultats des valeurs d'absorbance, de concentration et les rapports de pureté
sont affichés.
Appuyez sur F2 pour passer à l'échantillon suivant.
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Edition 02 – 08/2002
Français
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