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- la dynamique de l'image est de 8bits (256 niveaux de gris).
Ces paramètres sont à réserver pour des images de travail qui seront difficilement exploitables pour une
publication.
Comme cela a déjà été expliqué plus haut dans le chapitre concernant le plan expérimental, pour une
publication, il faut toujours opter pour une définition d'image supérieure ou égale au 1024x1024.
Pour obtenir une image parfaitement échantillonnée en xy il faut respecter la règle de Nyquist
(échantillonnage d'un signal sinusoïdal).
Pour simplifier, la taille du pixel doit être égale à la résolution divisée par un facteur 2,3. Pour cela il
suffit soit de se reporter aux colonnes "taille optimale du pixel" et "pas d'échantillonnage en z" des
tableaux de résolutions des différents objectifs présentés au début de ce manuel soit en cliquant sur l'onglet
"Configuration", puis sur "Objectif" et en pointant sur l'objectif utilisé on fait apparaître les paramètres de
celui-ci et notamment les résolu-
tions en xy et en z (exc. 488nm).
Note - les valeurs des tableaux
présentés pour chaque objectif,
au début du manuel sont des
valeurs réalistes et non théori-
ques. Elles sont donc un peu
moins
bonnes
que
indiquées par le système.
En fait cette définition optimale
est à réserver pour les images
destinées à une analyse spatiale
ou, pour celles comportant des
éléments très fins à résoudre :
fibres du cytosquelette, membra-
nes, etc.
Pour atteindre la définition opti-
male sans trop augmenter le
temps
d'acquisition
choisir de rétrécir le champ d'acquisition en adoptant un facteur de zoom.
Ainsi, a contrario, le facteur de zoom optimal peut être calculé pour une définition d'image de 1024x1024.
objectif
10x/0,3
20x/0,7
40x/1,25
63x/1,4
100x/1,4
Note - Attention il y a des limites au zooming !
Tout d'abord à partir d'un certain facteur de zoom la définition optimale des images va conduire à des
images de plus en plus pixelisées.
Mais surtout pour les forts grossissements, le risque de blanchiment des fluorochromes devient très
important car le spot d'éclairement confocal (qui a alors une taille bien supérieure à celle du pixel) va rester
quasi stationnaire sur la zone imagée.
6-6-3 Choix de la vitesse de scan
On a vu que, par défaut, la vitesse de scan "Speed" est de 400Hz.
Dans la plupart des cas c'est un bon choix. Toutefois il faut savoir qu'on peut améliorer le rapport signal/bruit
en diminuant la vitesse de scan car le tube photo-multiplicateur peut alors accumuler plus de photons (voir
tableau suivant), ce qui réalise un moyennage du signal et réduit le bruit de fond quantique (Poisson shot
noise) avec au final une amélioration du rapport signal/bruit.
Par contre en ralentissant la vitesse de scan on augmente le taux de blanchiment et pour des cellules
vivantes on accroît les risques de photo-toxicité.
Le système permet de monter à des vitesses supérieures mais cela se fait en imposant un facteur de zoom
minimum (voir tableau suivant). Bien sûr cela se fait au détriment du temps d'accumulation et avec une
détérioration du rapport signal/bruit.
celles
on
peut
405nm
x5,17
x6,00
x5,40
x3,81
x2,40
excitation
488nm
633nm
x4,29
x3,33
x4,98
x3,86
x4,45
x3,44
x3,16
x2,45
x1,99
x1,54
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