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Examen du frottis :
Placer la lame colorée sur la platine du microscope et centrer
l'objectif sur un cercle de départ. En mode sur fond clair, faire le point
sur le cercle de départ en utilisant un objectif de faible puissance et
progresser jusqu'à l'objectif d'examen de frottis souhaité. Passer en
mode fluorescence. En variante, le microscope peut être mis au point
en mode fluorescence en utilisant la procédure suivante : centrer
l'objectif sur le cercle de départ et ajuster la hauteur de la platine
juste au-dessus de la distance de travail de l'objectif, la source de
lumière de fluorescence étant active, regarder dans l'oculaire et faire
le point vers le bas avec le réglage fin jusqu'à ce que ce que le champ
soit net. (Conseil : lorsque la ligne fluorescente est mise au point, le
champ microscopique devient vert vif. Si le champ reste sombre, le
plan focal correct a été dépassé.) Déplacer le champ au bord de la
ligne fluorescente et répéter la mise au point.
Commencer à examiner le frottis à partir du cercle de départ en se
déplaçant au repère suivant. Les repères peuvent être utilisés afin de
compter le nombre de champs examinés si les champs sont examinés
de façon séquentielle sans se déplacer par saut dans le frottis (c'est-à-
dire que le déplacement de la platine est continu). Lorsque le repère
suivant est atteint, vérifier que le champ est net. Continuer l'examen
en se déplaçant d'un repère à un autre jusqu'à ce que le nombre
approprié de champs (la distance parcourue si le déplacement est
continu) spécifié par vos procédures opératoires standardisées soit
atteint. Rapporter les résultats.
Exemple d'examen de frottis :
Figure 1
La figure 1 ci-dessus décrit une lame SureFocus avec un trajet
d'examen suggéré. Pour ce trajet, localiser le point initial en utilisant
le cercle de départ 1. Examiner la lame verticalement et de façon
systématique, en se déplaçant vers le cercle de départ 3. Au cours
du déplacement de champ à champ, balayer avec un mouvement
continu en veillant à ne pas sauter des champs. Une fois que la ligne
2 est atteinte, veiller à ce que le microscope soit au point. Continuer
verticalement jusqu'au cercle de départ 3 et veiller à ce que le
microscope soit au point. Suivre une trajectoire horizontale vers la
ligne 4. Une fois que la ligne 4 est atteinte, vérifier que le champ est
au point. À ce stade, le nombre de champs suivants a été balayé si les
champs sont lus suivant un déplacement continu :
Nombre de champs
Grossissement
examinés
200x
400x
600x
1000x
Le tableau suivant présente les distances approximatives et les
champs de vision à des grossissements standard entre les repères :
26
52
78
130
Trajet
Distance
d'examen
(mm)
1 à 2 ; 2 à 3 ;
6,5
5 à 6 ; 6 à 7
1 à 8 ; 8 à 7 ;
11
3 à 4 ; 4 à 5
Procédure de contrôle qualité :
Les lames doivent être colorées avec des réactifs utilisés pour le
diagnostic d'échantillon de patient. Le technicien effectuant une
coloration d'échantillon de patient doit effectuer la coloration de
lame témoin selon les procédures de coloration d'échantillon. Les
frottis positifs et négatifs doivent être examinés par des techniciens
de laboratoire pratiquant le diagnostic d'échantillons de patient. Le
contrôle qualité doit être effectué en routine et conformément aux
réglementations en vigueur. Les résultats doivent être documentés.
1.
Colorer la lame de contrôle qualité F.A.S.T. QBC avec la lame
d'essai, en utilisant le kit de coloration à l'auramine O F.A.S.T.
conformément à la procédure ci-dessus.
2.
Maintenir les lames séparées pendant la procédure de
coloration afin d'éviter une contamination croisée des
réactifs de coloration d'une lame à une autre.
3.
Examiner la lame colorée à l'aide d'un microscope approprié
pour le type de coloration et enregistrer les résultats.
Une fluorescence inadéquate du témoin QC positif peut indiquer
une dégradation du réactif de coloration. Ne pas utiliser pour des
échantillons de patient jusqu'à ce que le problème soit corrigé.
Résultats attendus
En observant avec un microscope à fluorescence ayant une
configuration de filtre d'excitation bleu et d'émission vert (par
exemple, filtre d'excitation : 435 – 480 nm; filtre d'émission : 510 –
600 nm), les marquages sur la lame SureFocus doivent émettre une
fluorescence verte et constituent un moyen utile pour la mise au
point. Une fois la mise au point effectuée, des mycobactéries, telles
que celles contenues dans le témoin positif, et les autres organismes
acido-alcoolo-résistants émettent une fluorescence verte sur fond
sombre. Tous les autres organismes, tels que ceux contenus dans le
témoin négatif, doivent présenter les caractéristiques de coloration
d'arrière-plan. Un bacille fluorescent constitue une identification
provisoire d'espèce Mycobacterium.
Les mycobactéries dans le puits positif de la lame de contrôle qualité,
doivent émettre une fluorescence vert vif. Le témoin négatif doit
présenter les caractéristiques de coloration d'arrière-plan.
Si les résultats attendus ne sont pas obtenus, rechercher la cause
du problème, qui peut comprendre un défaut des réactifs, de
l'instrument, et des opérateurs. Si un défaut de témoin est suspecté,
utiliser un autre moyen pour tester le système tel qu'un échantillon
de patient (positif ou négatif connu). Ne pas produire de résultats de
patient tant que le défaut du système n'a pas été corrigé.
Limitations
Certaines mycobactéries à croissance rapide peuvent ne pas émettre
de fluorescence avec cette coloration. Les méthodes Ziehl-Neelsen,
Kinyoun, ou d'autres doivent être utilisées sur ces échantillons. La
fluorescence de frottis s'atténue progressivement avec le temps et
peut se dégrader en cas de chauffage et illumination excessifs, par
conséquent des échantillons colorés doivent être examinés dès que
possible.
Si aucun signal de fluorescence n'est observé en provenance des traits
sur les lames SureFocus, ne pas utiliser les lames pour la microscopie
de fluorescence.
Bien qu'un résultat positif indique la présence de mycobactéries,
un résultat négatif ne permet pas d'exclure une infection. D'autres
méthodes de diagnostic telles que la culture ou la PCR doivent être
2
Champs de vision
200x
400x
600x
7
14
21
12
24
36
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