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Chapitre 3
Les interactions entre le rayonnement électromagnétique et la matière fournissent un
outil analytique utile, qualitatif et quantitatif, connu sous le nom de spectroscopie. La
région du spectre électromagnétique, auquel la matière à étudier est soumise, définit le
type de transitions qui s'appliquent dans les molécules.
La fluorimétrie utilise le rayonnement de la région UV-Vis du spectre
électromagnétique pour étudier les transitions entre les niveaux électroniques dans
une molécule ou un atome. L'absorption de l'énergie du rayonnement lumineux
(photons) par une molécule ou un atome, fait passer les électrons d'un état
fondamental de faible énergie à un niveau énergétique supérieur excité. Ceci est
appelé excitation, et la quantité d'énergie transférée à la molécule ou à l'atome dépend
de deux facteurs principaux. La composition de la matière étudiée et l'énergie et la
longueur d'onde du rayonnement ont un effet significatif sur la transition des électrons.
La molécule ou l'atome convertit l'énergie d'excitation en énergie vibratoire ou
lumineuse et l'électron revient à son état fondamental. L'énergie vibratoire est
transférée par mouvement et collisions avec les autres molécules, mais l'énergie non
perdue de cette façon est libérée sous forme de rayonnement lumineux. L'émission
lumineuse est appelée fluorescence, et si une partie de l'énergie a été perdue sous
forme de vibration, elle présentera une énergie inférieure et une longueur d'onde
supérieure à l'énergie d'excitation. La longueur d'onde et l'intensité du rayonnement
émis dépendent de la structure et de la composition de la molécule et de la longueur
d'onde d'excitation utilisée.
Relation entre la concentration et la fluorescence
Le signal de fluorescence F et la concentration C de la matière étudiée sont liés par :
F = KQP
Où
= Caractéristique constante de l'appareil (y compris l'électronique de
K
l'appareil, le pH et la température)
Q
= Rendement Quantique (= Photons émis/Photons absorbés)
P
= Puissance du rayonnement incident
0
ε
= Absorptivité molaire du spécimen (matière)
= Trajet optique d'absorption
b
Si la concentration de la matière étudiée est faible (diluée),
est alors linéaire et l'équation peut être écrite ainsi :
ε
F = 2,3KQP
bC
0
La précision des mesures de fluorescence est très élevée car l'énergie de
rayonnement générée est mesurée directement. Les limites de sensibilité des mesures
de fluorescence sont peu nombreuses et facilement contrôlées. Dans l'équation ci-
dessus, on peut voir que les réglages effectués sur le bruit de fond électrique de
l'appareil et les rayonnements concurrents, ainsi que les limites physiques comme
l'énergie de rayonnement, le volume de l'échantillon et la taille de la cuve affectent la
sensibilité de la mesure.
Théorie de la fluorescence
ε
-
(1-10
bC
)
0
ε
bC est faible. La relation
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